La secuenciación completa del exoma es el test más avanzado que analiza todas las regiones codificantes del genoma, es decir, el exoma, el cual representa entre el 1 y el 2 % de la secuencia genómica completa y donde se hallan hasta el 85 % de las variantes genéticas reportadas como patogénicas. Es de gran utilidad en pacientes que padecen enfermedades con gran heterogeneidad genética, como el autismo, o que presenten un fenotipo complejo, donde el cuadro clínico no es lo suficientemente característico de una variante o de uno o varios genes específicos. Si la comparamos con la secuenciación completa del genoma, es menos costosa, su duración es menor y la interpretación y análisis de datos es menos compleja.

¿Qué es un exón?

Los exones son regiones del ADN que formar genes codificantes, los cuales luego darán lugar a las proteínas, mientras que los intrones tienen la misteriosa función espaciadora de los exones. Al conjunto de exones de un genoma, se le llama exoma.

Hasta hace poco tiempo sólo podíamos secuenciar pequeños trocitos con un coste muy elevado, con lo que podíamos tardar años en encontrar una mutación. A día de hoy, es factible, en un sólo experimento y a un costo relativamente bajo, secuenciar los exones de los más de 20.000 genes que componen el genoma humano, con lo que tenemos muchas posibilidades de hallar la mutación causante de la enfermedad que estamos estudiando.

Secuenciación masiva

La secuenciación completa del exoma, utiliza la tecnología Next-Generation Sequencing (NGS) o secuenciación de próxima generación con la plataforma de secuenciación Illumina HiSeq para obtener la información de variaciones genéticas de una manera más eficiente. Esta tecnología también conocida como secuenciación masiva ha revolucionado el diagnóstico genético, permitiendo el análisis de alteraciones de secuencia (mutaciones puntuales e indels) de múltiples genes en paralelo, posibilitando con ello un incremento de la tasa de éxito y la velocidad de obtención del diagnóstico molecular. Asimismo, ha evolucionado hasta posibilitar el cribado de grandes reordenamientos, secuenciar gran cantidad de segmentos de ADN de forma masiva y en paralelo, en menor cantidad de tiempo y a un menor costo por base. Su uso se dio inicialmente para detectar variantes de nucleótido único y cada vez se ha desarrollado para otro tipo de variantes, como inserciones, deleciones y grandes rearreglos.

Interés por el menor costo

Gracias a los recientes desarrollos en las pruebas basadas en NGS, estas tecnologías se plantean como estrategias de gran utilidad para la prevención, el diagnóstico, el tratamiento y el seguimiento de un amplio espectro de enfermedades, incluidas condiciones genéticas, patologías crónicas y enfermedades infecciosas, y se prevé que en un futuro cercano su creciente aplicación clínica generará resultados favorables para lograr el diagnóstico molecular en un número mayor de pacientes y a un menor costo. En la práctica clínica es creciente el uso actual de las pruebas basadas en NGS; sin embargo, aún existe incertidumbre sobre aspectos importantes como las indicaciones adecuadas para su uso, limitaciones de la técnica (sensibilidad y especificidad), reporte de variantes, interpretación de resultados, relación costo-beneficio y cobertura en el Plan Nacional de Salud.

Avanzada tecnología

Presenta una vasta capacidad para la identificación de enfermedades monogenéticas, tanto recesivas o dominantes; sin embargo, se debe tener presente que no está diseñada para identificar variantes patogénicas que se encuentren en regiones no codificantes (regiones de ADN que no tienen información que codifica para la proteína) como intrones o regiones promotoras. La interpretación de los resultados puede ser más compleja y puede ser más probable encontrar variantes de significado incierto o variantes que no se correlacionen con la clínica del paciente, en cuyo caso el estudio de familiares, como en el exoma trío, es decir, secuenciación de exoma del probando y sus dos progenitores (padre y madre), podría resultar útil.

Su uso clínico se ha propuesto, por ejemplo, como primera prueba diagnóstica en trastornos del neurodesarrollo.

 ¿Cuándo y a quién se recomienda?

El exoma está recomendado para pacientes sintomáticos sin diagnóstico con sospecha de discapacidad intelectual, retraso del desarrollo neuropsicomotor, autismo, malformaciones congénitas, entre otros.

Nosotros realizamos también el análisis de variaciones en el número de copias (CNVs) y ADN mitocondrial los que normalmente no son evaluados en otras instituciones, y cuando lo son, normalmente son cobradas adicionalmente.

El Exoma Clínico es un panel que evalúa la presencia de variantes clínicamente relevantes en genes previamente relacionados a enfermedades.

 ¿Cómo se validó la detección de CNVs mediante la técnica NGS (Next Generation Sequencing)?

Para incluir el análisis de las CNVs en el exoma, se realizó una extensa comparación de laboratorio entre los datos de MLPA(*), una técnica recomendada para la detección de CNVs, y NGS. Sobre la base de las pruebas comparativas de más de 8100 muestras pareadas, nuestro equipo de bioinformática desarrolló los algoritmos de análisis de detección de CNV a partir de datos NGS. La validación realizada en laboratorio, no dependiente de algoritmos externos, asegura la calidad (reproducibilidad, precisión y sensibilidad) de los resultados de NGS.

Técnica de MLPA (de sus siglas en inglés Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, amplificación de sondas tras ligación múltiple)

Detección de cambios en el genoma nuclear y el ADN mitocondrial
¿Por qué es importante analizar las variantes de ADN mitocondrial en el exoma?

Las mitocondrias tienen su propio ADN que contiene 37 genes. Las enfermedades mitocondriales pueden ser causadas por cambios en los genes del genoma nuclear y mitocondrial. Los cambios en los genes del genoma nuclear son comúnmente detectados por el exoma en varios laboratorios, pero un resultado negativo en esta prueba no excluye la presencia de una variante patogénica en el genoma mitocondrial.

Debido a la persistencia de la hipótesis de la enfermedad mitocondrial, es necesario complementar el análisis del exoma realizando un examen de panel de la enfermedad mitocondrial que evalúa los cambios en los genes mitocondriales.

Reanálisis de los datos de Exoma
¿Cuál es la importancia de volver a analizar los datos de Exoma con resultados no concluyentes o negativos?

El análisis de los datos del examen Exoma se basa en el conocimiento científico y clínico en el momento en que se emite el informe. Cada año, aparecen nuevos descubrimientos en el campo de la genética y están disponibles en revistas médicas o en una base de datos. Por lo tanto, los cambios genéticos presentes en la muestra del paciente, pero que no se describieron en el informe original, pueden ganar importancia clínica a la luz de nuevos descubrimientos.

Por esta razón, se recomienda que los resultados negativos o no concluyentes de Exoma sean reevaluados cada dos años o ante alguna nueva evidencia. Para el reanálisis de Exoma, no es necesaria una nueva recolección de muestras, ya que implica el reprocesamiento completo de los datos brutos del examen original, las etapas de bioinformática y el análisis médico. Pero es importante que el médico envíe información clínica actualizada.

¿Qué genes se analizan en el exoma?

En la mayoría de casos, en un primer análisis sólo se estudiarán aquellos genes que se conoce que son causa de la enfermedad, y no los 20,000 genes de un solo lance. Si en este primer análisis no se identifica ninguna alteración genética, se analizarán el resto de genes. Hay que tener en cuenta que, llegados a este punto, no podemos predecir cuándo, ni tan siquiera si se podrá identificar alguna alteración en algún gen que sea responsable de la enfermedad del paciente. En algunos casos, sí que se analizarán directamente la totalidad de los genes. Si este fuera su caso, su médico se lo comunicará.

Potencialidad de la secuenciación completa del exoma

El genoma humano comprende aproximadamente 3 X 10⁹ bases y contiene aproximadamente 180.000 regiones codificantes (vale decir el exoma), que constituyen aproximadamente el 1,7% de un genoma humano. Se estima que el 85% de las mutaciones que causan enfermedades ocurren en el exoma. Por esta razón, la secuenciación del exoma completo tiene el potencial de descubrir un mayor rendimiento de variantes relevantes a un costo mucho menor que la secuenciación del genoma completo . Se cree que la secuenciación completa del exoma es una forma eficiente y poderosa de identificar las variantes genéticas que afectan los fenotipos hereditarios, incluidas importantes mutaciones que causan enfermedades y variaciones naturales que pueden usarse para mejorar los cultivos y el ganado.

La secuenciación completa del exoma utiliza tecnología de captura del exoma para enriquecer los exones y luego secuencia estas regiones de manera de alto rendimiento. Para ser específicos, las muestras de ADN primero se fragmentan y se utilizan sondas de oligonucleótidos biotinilados (cebos) para hibridar selectivamente con el exoma en el genoma. Luego se utilizan perlas magnéticas de estreptavidina para unirse a las sondas biotiniladas. La porción no objetivo del genoma se elimina por lavado y la PCR se utiliza para enriquecer la muestra con ADN de la región objetivo. Posteriormente, la muestra es secuenciada por la plataforma Illumina HiSeq. Esta estrategia puede dar como resultado una mejora de hasta 100 veces en la cobertura genética del genoma humano. Los datos de secuenciación validados se utilizan luego para análisis de variantes y declaraciones clínicas.

¿Qué escenarios esperar de un examen de este tipo?

Podemos esperar cuatro posibles escenarios, que serían los siguientes:

1. Se identifican una o más alteraciones genéticas en genes que se sabe que son la causa de la enfermedad que estamos estudiando en tu caso. Podemos dar por identificado el caso. Aunque es casi seguro que tendremos que hacer estudios adicionales dirigidos a sus familiares (padres, hermanos y/o hijos) para llegar al diagnóstico genético definitivo.
2. Se identifican una o más alteraciones genéticas pero su significado no es evidente. En este caso, muy probablemente será necesario estudiar otros miembros de la familia para intentar determinar si esta alteración es relevante para explicar la enfermedad. Lógicamente esto quedará en sus manos informar a sus familiares y/o pedirles que participen en el estudio genético.
3. No se identifica ninguna alteración que pueda explicar tu enfermedad. En estas circunstancias el estudio podría continuar más adelante cuando esté disponible nuevo conocimiento que relacione tu enfermedad con nuevos genes. Se te informará en caso que esta situación se produzca en el futuro.
4. Cuando se analizan la totalidad de los genes, existe una pequeña probabilidad que se identifiquen alteraciones que no estén relacionadas con la enfermedad que se está estudiando. Un ejemplo de este tipo de hallazgo podría ser la identificación de una mutación en un gen que confiera riesgo elevado de sufrir cáncer o enfermedades neurológicas. Esto puede tener importantes repercusiones tanto para usted como para su familia. Deberá decidir si quieres o no ser informado en caso que se produzcan estos hallazgos inesperados. En caso que decidas ser informado, el genetista/grupo de genetistas discutirán cuáles de ellos tienen una repercusión clínica suficientemente relevante como para ser informados.

 ¿Y qué hacer luego de los resultados obtenidos con la secuenciación completa del exoma?

Aunque hoy no sea posible determinar la causa genética de tu enfermedad, sí que lo sea cuando el conocimiento avance. Esto significa que una alteración genética que se identifique hoy con la secuenciación del exoma y que se clasifique como de repercusión desconocida, puede ser reclasificada en un futuro como patogénica cuando el conocimiento avance. No obstante, es muy recomendable que, en caso que el análisis del exoma haya sido hoy inconcluyente, vuelvas a contactarte en un periodo de dos años a partir de la discusión de este estudio para saber si en este tiempo se hubiera generado nueva información que pueda ser relevante para tu caso.

 ¿Qué muestras biológicas se usan para secuenciar el exoma?

Aunque hoy no sea posible determinar la causa genética de tu enfermedad, sí que lo sea cuando el conocimiento avance. Esto significa que una alteración genética que se identifique hoy con la secuenciación del exoma y que se clasifique como de repercusión desconocida, puede ser reclasificada en un futuro como patogénica cuando el conocimiento avance. No obstante, es muy recomendable que, en caso que el análisis del exoma haya sido hoy inconcluyente, vuelvas a contactarte en un periodo de dos años a partir de la discusión de este estudio para saber si en este tiempo se hubiera generado nueva información que pueda ser relevante para tu caso.

 ¿Los resultados de secuenciación del exoma también tienen fines de investigación?

La información que se obtendrá del estudio del exoma es muy importante para el estudio de otras enfermedades genéticas. Los resultados de los análisis serán conservados de manera totalmente anónima y sólo su médico dispondrá de la clave para deshacer el anonimato. De esta manera, los datos obtenidos podrán ser compartidos de manera anónima con otros investigadores acreditados. Si como resultado de estas investigaciones se produjera algún descubrimiento relevante para su condición genética, su doctor será informado y será él quien te contacte para transmitir esta información.

Ventajas de la secuenciación completa del exoma

• Menor costo y amplia disponibilidad.
• Analiza ADN Nuclear y mitocondrial.
• Mayor cobertura de secuencia (por encima de 120X).
• Detección de variantes codificantes de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) tan sensibles como la secuenciación del genoma completo.
• Un conjunto de datos más pequeño para un análisis más rápido y sencillo en comparación con la secuenciación del genoma completo.
• En la mayoría de los casos, el análisis del exoma elimina la necesidad de realizar pruebas genéticas adicionales, ya que proporciona una gran cantidad de información sobre mutaciones en genes humanos.